一、概述
理論、實驗和模擬是解決未來科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)的三大支柱。將預(yù)測生物分子結(jié)構(gòu)、細(xì)胞動力學(xué)和功能的工具可以與基于實際研發(fā)工作相結(jié)合，不僅可以找到解決方案還能探究其機(jī)制。
通過基因工程合理設(shè)計CHO細(xì)胞，延長細(xì)胞壽命是提高產(chǎn)品濃度滴度的有效途徑?；贐ayesian inference的方法將CHO細(xì)胞凋亡抽象簡化定義為一階延遲衰減狀態(tài)，并將該數(shù)學(xué)模型以CRISPR基因編輯技術(shù)構(gòu)建的BCL-2效應(yīng)蛋白（Bak1、Bax、Box）敲除細(xì)胞中進(jìn)行實驗驗證。驗證結(jié)果KO Bak1、KO Bax協(xié)同具有強(qiáng)抗凋亡能力，而KO Bok 沒有顯著影響。對BCL-2效應(yīng)蛋白的研究對細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)至關(guān)重要，特別是目前灌流培養(yǎng)技術(shù)越來越受到追捧的當(dāng)下。
二、 基于Bayesian inference推導(dǎo)的數(shù)學(xué)模型
細(xì)胞從正常生長復(fù)制狀態(tài)轉(zhuǎn)變到細(xì)胞凋亡是一個多步驟協(xié)調(diào)的過程，研究用抽象模型的方式將活細(xì)胞分為三種狀態(tài)，并以這三種狀態(tài)來描述細(xì)胞凋亡的動力學(xué)過程?；罴?xì)胞群可以在這三種狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，活細(xì)胞總數(shù)定義為VCD（t）=R（t）+ Qa（t）+ Qc（t），被認(rèn)為是這三種狀態(tài)的總和。這個延遲微分方程模型模擬了細(xì)胞過渡的完整狀態(tài)。不同的解析解用于模型擬合活細(xì)胞密度數(shù)據(jù)。
凋亡程序涉及大量步驟，將其定義為延遲狀態(tài)即一階衰減。R細(xì)胞以特定的生長速率（以μ表示）指數(shù)分裂，并以特定的常數(shù)系數(shù)kq速率消失于靜止?fàn)顟B(tài)。τD：將細(xì)胞保持在Qa一段時間來實現(xiàn)的，然后將其移動到Qc，從該狀態(tài)以特定的常數(shù)系數(shù)kd速率發(fā)生死亡（Figure 1）。
三、 CHO細(xì)胞中敲除Bak1、Bax、Bok基因驗證建模結(jié)果
商業(yè)化的CHO細(xì)胞敲除BFP三種蛋白質(zhì)（Bak、Bax 和 Bok），共存在7種不同的基因敲除型組合，C(3|3)+ C(3|2)+ C(3|1)，對照組為空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
在不同基因型的敲除細(xì)胞中（Figure 2），都可以觀察到剛剛進(jìn)行細(xì)胞毒素處理時細(xì)胞存在延遲死亡狀態(tài)，停滯并沒有立即發(fā)生而是細(xì)胞維持正常生長后約24小時。且不同基因型間下降速率存在明顯差異，但puromycin處理的KO-bok和sodium butyrate處理的bok的除外。含有KO-bak1和KO-bax基因型的細(xì)胞生長停滯狀態(tài)較輕，且能夠在細(xì)胞死亡前表現(xiàn)出較高的活細(xì)胞密度及較長的細(xì)胞培養(yǎng)時間。由此得出結(jié)論KO-Bok對于CHO細(xì)胞抗凋亡功能無正相關(guān)，KO-Bak、KO-Bax可以提高CHO細(xì)胞的抗凋亡功能，KO-Bak、KO-Bax聯(lián)用比單獨(dú)敲除其中某一基因效果更加顯著。以上研究結(jié)果與模型理論計算結(jié)果一致。
四、生物過程中高滴度蛋白質(zhì)生產(chǎn)的應(yīng)激反應(yīng)模型實驗
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress, ER），是細(xì)胞為應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂等狀況，而激活未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)和 caspase-12 介導(dǎo)的凋亡通路等信號途徑的反應(yīng)過程。使用tunicamycin和brefeldin A模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡情況。在KO-bak1、KO-bax基因型和KO-bak1、KO-bax、KO-bok基因型中，活細(xì)胞密度較高且能夠維持較長的細(xì)胞培養(yǎng)時長，但單一KO-bok的細(xì)胞株表現(xiàn)與對照細(xì)胞系相似，呈現(xiàn)明顯凋亡狀態(tài)。
對KO-bok基因型效應(yīng)進(jìn)行建模結(jié)果同樣顯示，無論在tunicamycin或brefeldin A處理下KO-bok基因?qū)OO分?jǐn)?shù)影響不大。細(xì)胞受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是，KO-bok單獨(dú)作用或與其他效應(yīng)蛋白聯(lián)用時，都不會產(chǎn)生延長細(xì)胞存活時間或降低死亡率效應(yīng)。但KO-bak1和KO-bax的作用效果十分顯著（Figure 3）。以上研究結(jié)果與模型理論計算結(jié)果一致。
五、結(jié)語
凋亡是一個多步驟協(xié)調(diào)的過程，研究用抽象模型描述了這種復(fù)雜的細(xì)胞動力學(xué)過程。通過實驗驗證及理論推到均可得KO-Bak1和KO-Bax能夠延遲細(xì)胞死亡；KO-Bok對CHO細(xì)胞培養(yǎng)沒有任何影響。數(shù)學(xué)模型預(yù)測及實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡的發(fā)生不僅不是離散的而且可能是可逆的。細(xì)胞凋亡發(fā)生的延遲研究可能對抗體生產(chǎn)的灌注反應(yīng)提供問題解決的新思路。
