生物藥規(guī)?；a(chǎn)均起源于一支凍存細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇是決定規(guī)?；紊a(chǎn)能否正常進(jìn)行的關(guān)鍵因素，因此細(xì)胞復(fù)蘇的成敗有著重要意義。

細(xì)胞在液氮中可長期凍存，因此生物藥規(guī)?；a(chǎn)使用的細(xì)胞庫都是在液氮中進(jìn)行凍存（-196°C）。細(xì)胞在液氮中凍存會(huì)將自身活力降至最低或停止，想讓細(xì)胞恢復(fù)活力就需要將細(xì)胞復(fù)溫解凍。細(xì)胞在冷凍狀態(tài)下復(fù)溫解凍使其重新獲得自身活力、恢復(fù)生長的過程稱為細(xì)胞復(fù)蘇。如何讓細(xì)胞在復(fù)蘇的過程中不受損傷，獲得原有活力就需要通過一些技術(shù)要點(diǎn)來控制細(xì)胞復(fù)蘇的過程，本文將針對(duì)細(xì)胞復(fù)蘇過程的技術(shù)要點(diǎn)做探討。（無菌操作做為細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)關(guān)鍵技術(shù)在此不做詳述）

凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

凍存細(xì)胞從液氮罐中取出后需要在小型液氮轉(zhuǎn)移罐或干冰的保護(hù)下轉(zhuǎn)移至復(fù)蘇區(qū)域，避免在無低溫（＞-70°C）條件下轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞。如在無低溫條件下轉(zhuǎn)運(yùn)凍存細(xì)胞，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中凍存細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)緩慢解凍情況，有研究表明當(dāng)凍存的細(xì)胞復(fù)溫至-40°C以上時(shí)細(xì)胞內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生冰晶給細(xì)胞造成致命損傷。因此，為保證細(xì)胞復(fù)蘇后能有較好的活力在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)的溫度控制至關(guān)重要。

水?。◤?fù)溫解凍）

在實(shí)際操作中，復(fù)蘇細(xì)胞需要采用快速復(fù)溫解凍的方法，避免由于緩慢復(fù)溫解凍造成水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶，從而對(duì)細(xì)胞造成損傷。因此需要借助水浴設(shè)備來完成復(fù)溫解凍，水浴溫度應(yīng)在37°C為最佳。水浴過程中需要輕輕搖動(dòng)凍存管，使凍存管中的細(xì)胞均勻受熱快速完成復(fù)溫解凍過程，水浴復(fù)溫解凍時(shí)間一般為2分鐘最長不應(yīng)超過3分鐘。輕搖凍存管是為在細(xì)胞均勻受熱的同時(shí)避免凍存管蓋和管體的連接處與水有接觸造成污染風(fēng)險(xiǎn)。

凍存保護(hù)劑二甲基亞砜（DMSO）清除及離心

已經(jīng)完成復(fù)溫解凍的細(xì)胞應(yīng)避免在常溫狀態(tài)下長時(shí)間存放，因?yàn)榧?xì)胞在凍存時(shí)會(huì)加入一定量的DMSO，其特有的滲透性在常溫下對(duì)細(xì)胞的傷害較大，應(yīng)盡快使用培養(yǎng)基稀釋凍存管中的細(xì)胞及離心去除DMSO從而盡可能的減小DMSO對(duì)細(xì)胞的傷害。離心速度和時(shí)間可控制在1200 rpm/min 4 min，離心轉(zhuǎn)速低時(shí)需要相應(yīng)增加離心時(shí)間（如1000 rpm/min 6 min），但不推薦使用高轉(zhuǎn)速離心。高轉(zhuǎn)速會(huì)使細(xì)胞出現(xiàn)破碎情況，造成復(fù)蘇活率降低不利于后期培養(yǎng)傳代。

結(jié)語

穩(wěn)定可控的細(xì)胞復(fù)蘇過程會(huì)在后期傳代培養(yǎng)過程中得到近乎一致的傳代數(shù)據(jù)，盡可能減少規(guī)?；a(chǎn)中種子擴(kuò)培階段對(duì)細(xì)胞密度和活率的影響，為規(guī)?；a(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)的種子擴(kuò)培基礎(chǔ)，降低生產(chǎn)培養(yǎng)批間差異，提高生物藥規(guī)?；a(chǎn)成功率。