生物制藥工業(yè)主要采用中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞生產(chǎn)穩(wěn)定的單克隆抗體（mAbs），雖然連續(xù)操作工藝已經(jīng)成功地應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)，但生物制藥工業(yè)的主流仍然是Fed-batch的培養(yǎng)方式，而不是連續(xù)或灌注式培養(yǎng)。

傳統(tǒng)的Fed-batch培養(yǎng)方式接種活細(xì)胞密度（VCD）約為0.5E6vc/ml。通過種子培養(yǎng)階段（N-1階段）引入灌流培養(yǎng)或工藝強(qiáng)化，將Fed-batch生產(chǎn)階段（N階段）中的接種密度提高到2-10E6 vc/ml，縮短培養(yǎng)生產(chǎn)時(shí)間并提高抗體產(chǎn)量。

本文研究表明，在同樣的14天時(shí)間內(nèi)，提高接種密度可以顯著提高3個(gè)CHO GS細(xì)胞系生產(chǎn)的3種抗體的產(chǎn)量。研究證實(shí)在N-1步驟中使用Fed-batch的方法或使用富集培養(yǎng)基的非灌流方法同樣可以獲得22-34E6 vc/ml的高密度。將非灌流培養(yǎng)的N-1高密度種子接種到N階段的生物反應(yīng)器中，其接種VCD可達(dá)3-6E6 vc/ml，采用上述方式取得的抗體產(chǎn)量和質(zhì)量屬性與使用灌流式N-1種子接種的生物反應(yīng)器相當(dāng)。為了在N-1階段獲得高密度，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的富集在N-1階段和隨后的Fed-batch生產(chǎn)階段中至關(guān)重要。與需要灌流設(shè)備的灌流N-1培養(yǎng)方式相比，非灌流N-1方法在操作上要簡單得多，可用于工藝開發(fā)、工藝表征和大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)。

強(qiáng)化接種密度可提高Fed-batch生產(chǎn)培養(yǎng)的抗體產(chǎn)量

為了研究不同的接種密度和其他相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)對最終產(chǎn)量的影響，首先在96個(gè)50ml的TubeSpin中對采用3個(gè)不同CHO K1 GS細(xì)胞系表達(dá)的3個(gè)抗體進(jìn)行Fed-batch細(xì)胞培養(yǎng)評(píng)估。在TubeSpin培養(yǎng)中，篩選的因素是接種密度、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的富集程度、第一次添加補(bǔ)料的時(shí)間，以及每天的補(bǔ)料量占初始工作容積的百分比。如細(xì)胞系A(chǔ)（圖1：A-1）、細(xì)胞系B（圖1：B-1）和細(xì)胞系C（圖1：C-1）的杠桿圖所示，接種密度對提高3個(gè)細(xì)胞系的最終產(chǎn)量貢獻(xiàn)最大。在最佳條件下，當(dāng)接種密度由0.5E6 vc/ml增加到6E6 vc/ml時(shí)，細(xì)胞系A(chǔ)的滴度增加了3倍多。在較高的接種條件下，細(xì)胞系B和C也有類似的反應(yīng)，Titer分別增加1.7倍和2.3倍。結(jié)論得出提高接種密度，從傳統(tǒng)的0.5E6 到6E6 vc/ml，顯著提高了3個(gè)抗體的最終產(chǎn)量。

采用非灌流式CHO種子培養(yǎng)獲得更高的最高細(xì)胞密度

高接種密度的Fed-batch生產(chǎn)培養(yǎng)，在N-1種子培養(yǎng)階段需要明顯更多的細(xì)胞數(shù)量。為了評(píng)估N-1種子培養(yǎng)的非灌流方法是否能獲得足夠高的VCD，將3種非灌流N-1種子培養(yǎng)策略，即常規(guī)Batch、富集Batch和Fed-batch與灌流N-1培養(yǎng)進(jìn)行了比較（圖2和表1）。

第一個(gè)實(shí)驗(yàn)考察了3個(gè)CHO K1 GS細(xì)胞系（接種密度:2E6 vc/ml）在Batch模式下使用3種不同的Batch培養(yǎng)基的N-1種子培養(yǎng)生長概況（圖2和表1）。這3種種子培養(yǎng)基是OptiCHO、種子培養(yǎng)基（BM）和富集種子培養(yǎng)基（EBM）（表2）。如表2所示，相對的營養(yǎng)水平，以及滲透壓的增加順序?yàn)镺ptiCHO < BM < EBM。Batch培養(yǎng)種子的VCD峰值是按照OptiCHO、BM和EBM的順序增加的（表2）。所有使用OptiCHO培養(yǎng)基的細(xì)胞系的VCD都明顯較低（6-13 E6 vc/ml），第6天的存活率下降到73-86%（圖2B，D，F(xiàn)）。BM種子條件下的生長達(dá)到了15-26E6 vc/ml的峰值VCD，但從第5-7天開始，細(xì)胞系A(chǔ)的VCD（圖2A）和細(xì)胞活力（圖2B）明顯下降，從第4-6天開始，細(xì)胞系B和C的VCD（圖2C-2F）明顯下降。這種VCD和存活率的快速下降在生產(chǎn)中構(gòu)成了風(fēng)險(xiǎn)。最好的結(jié)果是EBM的Batch培養(yǎng)，在6-7天的培養(yǎng)過程中達(dá)到了23-32E6 vc/ml的峰值VCD和高活力（圖2和表1）。因此，EBM條件被選為N-1培養(yǎng)基條件。應(yīng)該注意的是，過多的培養(yǎng)基富集可能導(dǎo)致N-1種子培養(yǎng)物中的CHO細(xì)胞生長受到抑制（數(shù)據(jù)未顯示），這是因?yàn)檩^高的滲透壓、較高濃度的葡萄糖或其他不明的抑制因素而引發(fā)的。

這3個(gè)細(xì)胞系還在Fed-batch和灌流培養(yǎng)中進(jìn)行了評(píng)估（表1和圖2）。細(xì)胞系A(chǔ)的Fed-batch種子培養(yǎng)取得了22E6 vc/ml的峰值VCD，這與EBM Batch培養(yǎng)條件相似（圖2A）。細(xì)胞系B和C的Fed-batch種子培養(yǎng)的峰值VCD分別為32E6 和34E6 vc/ml（圖2C，E），都略高于EBM Batch培養(yǎng)條件。此外，所有3個(gè)細(xì)胞系在Fed-batch模式下的種子培養(yǎng)的存活率都非常好，保持在99%左右（圖2）。眾所周知，灌流式N-1培養(yǎng)能使細(xì)胞保持在指數(shù)增長階段，并能獲得高的VCD。正如預(yù)期的那樣，灌流式N-1培養(yǎng)物取得了明顯較高的VCD，分別為44E6，41E6 和62 E6 vc/ml，細(xì)胞系A(chǔ)、B和C在第5天的存活率皆為99%（圖2和表1）。

非灌流式N-1種子可用于接種強(qiáng)化Fed-batch生產(chǎn)

非灌流式N-1種子培養(yǎng)獲得了高VCD和好的存活率之后，接下來評(píng)估這些N-1種子在強(qiáng)化的Fed-batch生產(chǎn)中的表現(xiàn)。

對于細(xì)胞系A(chǔ) N階段Fed-batch培養(yǎng)是用同樣的接種密度5E6 vc/ml（圖3A[朱光凱1] ）接種不同培養(yǎng)方式的種子。接種灌流N-1種子的生產(chǎn)培養(yǎng)物達(dá)到了最高的細(xì)胞密度，為22E6 vc/ml，而接種富集Batch或Fed-batch N-1種子的N階段VCD峰值為17E6 vc/ml（圖3A）。然而，所有培養(yǎng)物最終產(chǎn)量是相似的，從0.96 -1.00（圖3B）。因此，雖然灌流N-1種子條件下取得了更高的VCD峰值，但這并沒有導(dǎo)致這些培養(yǎng)物的最終產(chǎn)量顯著增加。最重要的是，無論N-1種子如何操作，產(chǎn)品質(zhì)量屬性，包括電荷變體、SEC雜質(zhì)和N-聚糖概況，對所有Fed-batch產(chǎn)物都是相似的（圖3C）。對于細(xì)胞系B，使用第5天的N-1種子在富集Batch、Fed-batch和灌流模式下培養(yǎng)的種子分別以3E6 vc/ml的密度進(jìn)行接種（圖4）。與細(xì)胞系A(chǔ)類似，使用灌流式N-1種子接種的Fed-batch培養(yǎng)取得了最高的VCD峰值，但同樣，在不同N-1條件下，抗體產(chǎn)量都是相似的，即0.33-0.36（圖4B）。對于細(xì)胞系C，以6E6 vc/ml的密度接種，使用來自Fed-batch或灌流模式的第5天N-1種子進(jìn)行培養(yǎng)（圖5）。同樣，兩種生產(chǎn)培養(yǎng)物達(dá)到出相似的抗體產(chǎn)量和質(zhì)量屬性。

使用非灌流式N-1種子強(qiáng)化的Fed-batch工藝可以在500升或1000升的生物反應(yīng)器中放大培養(yǎng)

細(xì)胞系A(chǔ)和B的富集batch N-1種子分別用于接種1000L（圖6）和500L生物反應(yīng)器（圖7）中的強(qiáng)化Fed-batch生產(chǎn)培養(yǎng)，而細(xì)胞系C的Fed-batch的N-1種子則用于接種500L生物反應(yīng)器中的強(qiáng)化Fed-batch生產(chǎn)培養(yǎng)（圖8）。所有3個(gè)細(xì)胞系培養(yǎng)過程都被證明在500L或1000L生物反應(yīng)器中是可擴(kuò)展的。細(xì)胞密度、抗體產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量概況與5L生物反應(yīng)器中的一致（圖6-8）。

討論

生產(chǎn)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基的富集與高接種量VCD有協(xié)同作用，高接種密度的Fed-batch培養(yǎng)可提高所有3種不同mAb的產(chǎn)量（圖1：A-2，B-2和C-2）。此外，富集的N-1種子培養(yǎng)基通過在N-1階段支持較長的培養(yǎng)時(shí)間而獲得較高的最終VCD（圖2A，C，E），隨后足以支持N階段生產(chǎn)步驟所需的較高接種密度（圖3和4）。因此，富集的培養(yǎng)基既有利于非灌流N-1種子獲得更高的最終VCD，也有利于強(qiáng)化Fed-batch生產(chǎn)步驟，獲得更高的最終產(chǎn)量或更短的生產(chǎn)時(shí)間。

非灌流和灌流培養(yǎng)的N-1種子，其最終的VCD比傳統(tǒng)的N-1種子高得多，可以用較小的N-1生物反應(yīng)器接種較大的N階段生產(chǎn)型生物反應(yīng)器，以達(dá)到相同的接種密度，從而縮短種子培養(yǎng)時(shí)間。使用富集的Batch種子來取代傳統(tǒng)的N-1種子，可以為傳統(tǒng)的5000L生物反應(yīng)器生產(chǎn)省去至少一個(gè)種子生物反應(yīng)器步驟。

非灌流式N-1種子培養(yǎng)策略優(yōu)點(diǎn)是：（1）易于細(xì)胞培養(yǎng)過程的開發(fā)和操作；（2）不需要專門的灌流設(shè)備，也不需要準(zhǔn)備和儲(chǔ)存大量的灌流培養(yǎng)基；（3）在大多數(shù)大規(guī)模的商業(yè)生產(chǎn)設(shè)施中易于實(shí)現(xiàn)。

與傳統(tǒng)的Batch工藝相比，用非灌流種子接種的強(qiáng)化Fed-batch工藝取得了更高的VCD曲線（數(shù)據(jù)未顯示），這表明收獲時(shí)宿主細(xì)胞蛋白（HCP）可能更高。由于無論接種量大小，在純化前的HCP值都非常高，所以收獲時(shí)未測量HCP。盡管如此，這3種mAbs和其他許多蛋白質(zhì)在最終配制的藥物中的HCP水平是相似的。這表明下游工藝足以去除細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的HCP，而不受不同接種細(xì)胞密度的影響。

（雖然本研究中只使用了由CHO細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的3種穩(wěn)定的mAbs，但非灌流式N-1種子策略的基本原則是縮短種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)時(shí)間或提高titer，應(yīng)該適用于在任何規(guī)模的生物制品設(shè)施中由不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和其他宿主生產(chǎn)的其他蛋白質(zhì)。）

參考文獻(xiàn)：

Andrew Yongky, Jianlin Xu, Jun Tian, Christopher Oliveira, Jia Zhao, Kevin McFarland, Michael C. Borys & Zheng Jian Li (2019) Process intensification in fed- batch production bioreactors using non-perfusion seed cultures, mAbs, 11:8, 1502-1514, DOI: 10.1080/19420862.2019.1652075

1、擁有先進(jìn)的培養(yǎng)基平臺(tái)、Fed-batch工藝開發(fā)平臺(tái)、灌流工藝開發(fā)平臺(tái)，工藝平臺(tái)在行業(yè)內(nèi)具有顯著的領(lǐng)先優(yōu)勢，可高效提高抗體的產(chǎn)量并優(yōu)化質(zhì)量

2、強(qiáng)大的Knowhow能力，自主開發(fā)的Maxexpression系列培養(yǎng)基已用于上市項(xiàng)目1項(xiàng)， 超過10項(xiàng)目進(jìn)入臨床階段，表達(dá)量＞5g/L。Maxexpression系列培養(yǎng)基平臺(tái)是與時(shí)俱進(jìn)的平臺(tái)，始終保持行業(yè)先進(jìn)性，為客戶提供快速、低成本、高產(chǎn)量、高質(zhì)量的項(xiàng)目開發(fā)服務(wù)

3、商業(yè)培養(yǎng)基研究應(yīng)用作為重點(diǎn)之一，并建立先進(jìn)商業(yè)培養(yǎng)基庫，為客戶提供高質(zhì)量而靈活的選擇