引言 FosterBio
重組治療性蛋白主要采用穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在大規(guī)模生物反應(yīng)器生產(chǎn)所得。然而，快速高效生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)的主要限制之一是細(xì)胞系的構(gòu)建及表征，該過(guò)程往往是較為費(fèi)力和耗時(shí)的。細(xì)胞系構(gòu)建主要是將基因遞送到培養(yǎng)細(xì)胞中，大多數(shù)轉(zhuǎn)染及整合方法是依賴于外源基因隨機(jī)整合的。使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法將表達(dá)質(zhì)粒整合到宿主細(xì)胞基因組的高度轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的概率很低，并且絕大多數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白表達(dá)水平不足。此外，細(xì)胞在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，外源基因表達(dá)量會(huì)下降。因此，必須篩選大量的候選細(xì)胞系，才能獲得一些高產(chǎn)細(xì)胞系。為提高外源基因整合效率，并篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株，可采用PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子表達(dá)系統(tǒng)，將外源基因整合至基因組中。
轉(zhuǎn)座子的出現(xiàn)為構(gòu)建基因編輯細(xì)胞株提供了一個(gè)全新的視野。轉(zhuǎn)座子也被稱為跳躍基因，由Barbara McClintock教授在上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)，是指一段DNA序列由基因組的一個(gè)位置跳躍到另一個(gè)位置。轉(zhuǎn)座子主要包含兩種類型：逆轉(zhuǎn)座子（retrotransposons），自身不表達(dá)轉(zhuǎn)座酶，先轉(zhuǎn)錄為RNA，通過(guò)RNA的反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，cDNA在整合酶的作用下轉(zhuǎn)移到其他基因組位置。DNA轉(zhuǎn)座子（DNA transposons），通過(guò)自身編碼的轉(zhuǎn)座酶直接切割轉(zhuǎn)座子所在DNA序列，實(shí)現(xiàn)序列的轉(zhuǎn)移。以睡美人轉(zhuǎn)座子（SleepingBeauty）和PiggyBac轉(zhuǎn)座子等DNA轉(zhuǎn)座子最為常見(jiàn)。PiggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制PB是一種II類轉(zhuǎn)座元件，最初來(lái)源于卷心菜環(huán)蛾（Trichoplusia ni），它特異性靶向DNA中的TTAA四核苷酸位點(diǎn)，PB轉(zhuǎn)座子長(zhǎng)度為2472bp，由PB轉(zhuǎn)座酶（PBase）基因組成，該基因兩側(cè)有轉(zhuǎn)座所需的末端重復(fù)序列。
轉(zhuǎn)座通過(guò)“剪切和粘貼”機(jī)制發(fā)生，在該機(jī)制中，PBase最初識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)座子末端。然后，它將整個(gè)轉(zhuǎn)座子從其原始位置切除，并通過(guò)一種不依賴于宿主因子的機(jī)制催化其插入另一個(gè)染色體位點(diǎn)。PiggyBac雙載體系統(tǒng)及優(yōu)點(diǎn)PB轉(zhuǎn)座子衍生的雙載體系統(tǒng)由（i）攜帶人工轉(zhuǎn)座子的供體載體和（ii）驅(qū)動(dòng)PBase表達(dá)的輔助載體組成，人工轉(zhuǎn)座基因具有兩側(cè)為PB左右末端結(jié)構(gòu)域的哺乳動(dòng)物表達(dá)盒。使用PB系統(tǒng)獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞系有幾個(gè)潛在的優(yōu)點(diǎn)。? 首先，供體和輔助載體的共轉(zhuǎn)染可介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效外源基因整合，包括工業(yè)界常用宿主細(xì)胞系，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）和人類胚胎腎細(xì)胞（HEK293）；? 其次，PB整合位點(diǎn)的定位研究證明，PB有利于轉(zhuǎn)座到宿主基因組的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域；? 第三，已經(jīng)表明PB轉(zhuǎn)座子可有效介導(dǎo)高達(dá)14kbp的DNA轉(zhuǎn)座至宿主中；? 第四，PB轉(zhuǎn)座可以整合目的基因的序列，從而降低非功能外源基因整合的概率；? 最后，已經(jīng)證明了使用PB系統(tǒng)可將單個(gè)或多個(gè)基因持續(xù)表達(dá)。PiggyBac轉(zhuǎn)座子雙載體系統(tǒng)比傳統(tǒng)的隨機(jī)整合技術(shù)更有益于獲得高產(chǎn)穩(wěn)定的細(xì)胞株PB雙載體系統(tǒng)被用作外源基因遞送載體，用于構(gòu)建表達(dá)治療性重組蛋白的穩(wěn)定CHO細(xì)胞系。通過(guò)評(píng)估源自兩種基因遞送方法的克隆細(xì)胞系的生產(chǎn)力、長(zhǎng)期穩(wěn)定性和外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行比較：1.PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系的效率高于傳統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PB雙載體系統(tǒng)獲得穩(wěn)定細(xì)胞系的效率比傳統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高出22倍（表I）。使用20%或更多pmPBase轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在培養(yǎng)21天后觀察到相近百分比的EGFP陽(yáng)性細(xì)胞，表明轉(zhuǎn)座酶達(dá)到飽和水平，超過(guò)該水平，穩(wěn)定細(xì)胞系生成的效率沒(méi)有提高。
2.PB轉(zhuǎn)座獲得高表達(dá)的克隆概率高于傳統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
以9:1的donor與helper質(zhì)粒的比例進(jìn)行研究，在10或50mg/mL嘌呤霉素中選擇2周后，在對(duì)每個(gè)細(xì)胞池進(jìn)行有限稀釋，將單細(xì)胞鋪板到96孔板中。在含有PBase[PB（10）和PB（50）]的條件下獲得的克隆比無(wú)PBase時(shí)獲得的克隆[TX（10）或TX（50）]具有更高的生產(chǎn)力（圖3A）。在pmBPase存在的情況下，30-35%的克隆產(chǎn)量為50 mg/L或更高水平（圖3B）。相反，在缺乏PBase的情況下沒(méi)有一個(gè)克隆表達(dá)超過(guò)50mg/L（圖3B）。
3.PB轉(zhuǎn)座子獲得的細(xì)胞池及克隆中外源基因表達(dá)可維持長(zhǎng)期的穩(wěn)定性
以9:1的donor與helper質(zhì)粒的比例進(jìn)行研究，高或低選擇時(shí)細(xì)胞池的差異約為六倍（表II）。在為期16周的穩(wěn)定性研究中，沒(méi)有觀察到PB轉(zhuǎn)座獲得的細(xì)胞池產(chǎn)量的變化（圖2）。16周內(nèi)的變異系數(shù)PB（50）為17%和PB（10）為13%（表II）。
選擇了上述克隆產(chǎn)量最高的四組進(jìn)行穩(wěn)定性研究。與細(xì)胞池獲得的結(jié)果一樣，通過(guò)PB轉(zhuǎn)座獲得的克隆在14周培養(yǎng)期內(nèi)沒(méi)有觀察到產(chǎn)量的變化（圖4），且平均體積生產(chǎn)率的變異系數(shù)＜20%（表II）。通過(guò)PB轉(zhuǎn)座獲得的克隆細(xì)胞系在沒(méi)有選擇的情況下是穩(wěn)定的。
將上述16個(gè)克隆穩(wěn)定性研究的開(kāi)始（第1周）和結(jié)束（第14周）時(shí)收集的細(xì)胞通過(guò)1周分批培養(yǎng)的方式來(lái)分析細(xì)胞特異性生產(chǎn)力和生長(zhǎng)。在第1周和第14周，通過(guò)PB轉(zhuǎn)座獲得的8個(gè)克隆的總比生產(chǎn)率平均為26 pg/細(xì)胞/天，比通過(guò)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染獲得的細(xì)胞系的平均比生產(chǎn)率高3.3倍（圖5）。
賦成生物的PiggyBac轉(zhuǎn)座子雙載體技術(shù)平臺(tái)PB轉(zhuǎn)座的細(xì)胞池可獲得更多的重組蛋白。PB轉(zhuǎn)座獲得高產(chǎn)單克隆的概率大、數(shù)量多，并且具有更高的體積生產(chǎn)力和外源基因拷貝數(shù)量。在沒(méi)有選擇的情況下，通過(guò)PB轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的細(xì)胞池和單克隆細(xì)胞系的體積生產(chǎn)力穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。PB轉(zhuǎn)座可減少重組細(xì)胞系篩選的復(fù)雜程度及工作量，可應(yīng)用于高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株開(kāi)發(fā)。賦成生物根據(jù)項(xiàng)目需求，可采用PB系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞株構(gòu)建及篩選。
參考文獻(xiàn)
Mattia Matasci, Lucia Baldi, David L. Hacker, Florian M. Wurm .2011.The PiggyBac Transposon Enhances the Frequency of CHO Stable Cell Line Generation and Yields Recombinant Lines With Superior Productivity and Stability. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 108, No. 9, September, 2011 2141-2150
